Chapter 11

11.1 Summary

Chapter 1 indicates the purpose of this thesis: to investigate the effect of long term hypergravity on the function (vestibular controlled behaviour) and the structure (the otoconial layer of the otolith organs) of the vestibular system. A short introduction is presented about motion sickness concerning definition, symptoms and etiology. It describes further the role of the vestibular system in the genesis of Space Motion Sickness (SAS) and Sickness induced by long duration Centrifugation (SIC) and the relationship which exists between both syndromes.

Chapter 2 gives a short introduction to the vestibular system with the emphasis on the peripheral vestibular system. This system consists of the otolith organs (utricle and saccule) and the semicircular canals. The genesis and physiology of the gravity sensing otolith organs, especially the otoconial layer, is discussed in detail. A brief overview is presented of the central vestibular system.

In chapter 3 the effects of hyper-gravity on the anatomy of small animals (body weight, bones and muscles, cardiovascular system, reproduction and the vestibular system) are evaluated. Extra attention is paid to the effects of hypergravity on the behaviour of animals after return to normal gravity.

Prolonged hypergravity leads to less body weight, especially noticeable in the decreased body fat. The higher G-load is also responsible for the structural changes observed in the femurs which- become thicker, shorter, denser and have a greater ability to oppose bending than the ones of controls. Analysis of muscle fibre composition shows that in hypergravity fast fatiguing (FOG) fibres are conversed to more resistant fatigue-resistant (SO) fibres to survive the higher mechanical stress. The higher energy demands during hypergravity results in a decrease in the mitochondria and an increase in lipofus-cine in the myocardium and liver suggesting a faster ageing of organs in the HG animals. An increase is found in the formation of red blood cells (erythropoiesis) arising from increased metabolic processes.

Hypergravity during embryonal development causes deformations of the embryos resulting in a decreased number of living pups especially during higher G loads. At high G-loads the number of surviving pups decreases even more due to the lack of nursing behaviour of the mothers or to the inability of the newborns to endure the hypergravity.

In the vestibular end-organs, hypergravity results in a redistribution of saccular otoconia in the direction of the gravitational force and a thicker "accessory" membrane of the saccule. Differences are also found in the lateral vestibular nucleus and cerebellar nodulus of HG rats and the vestibular evoked behaviour (locomotion, balancing and air-righting) in these animals when compared to rats living in normal gravity.

In chapter 4 the pilot experiment is described. This experiment focusses on tasks that can assess differences in perceptive-motor skills between hamsters exposed to long term hypergra-vity (2.5 G) and hamsters living in a normal gravity environment (1 G). During 4 months, tests were carried out to study equilibrium maintenance, swimming behaviour and open field behaviour of these animals. The tests proved to be useful for detecting differences between these groups in perceptive-motor behaviour. The hyper-gravity hamsters had more difficulties with balancing on tubes and orientation during swimming and showed less locomotor activity in the open field than control hamsters. No differences were observed between the groups in washing, rearing and defecating. These findings indicate that the daily transition from 2,5 to 1 G is not experienced as stressful by the hamsters, although their performance on several perceptive motor tasks deteriorated during the first weeks.

In chapter 5 the effect of hyper-gravity on the otoconial layer of the otolith organs is investigated. Hamsters were placed in the centrifuge under conditions of 2.5 G and stayed there for 6 months. Afterwards, the calcium contents, size, shape and distribution of the otoconia were determined with energy dispersive X-ray element analysis (EDAX) and scanning electron microscopy (SEM). No differences were found in these variables between centrifuged hamsters and controls. It is concluded that structural adaptation to hypergravity does not take place at the otoconial level, at least not in animals which are subjected to hypergravity after the vestibular system is fully matured.

In chapter 6 the effect of hypergravity on the behaviour of the hamsters of chapter 5 is discussed. The motor coordination of the hypergravity hamsters hardly changed; locomo-tion was normal and swimming was possible. Equilibrium maintenance was disturbed during the first 3 months for the hypergravity group when compared to controls. Differences were also found in orientation during swimming and turning behaviour in the rotation and no-rotation task. After 6 months, 10 hamsters of both groups were tested for another 4 months, when the hyper-gravity hamsters were also living at 1 G. Differences in orientation in the two groups did not change during swimming and turning behaviour in the rotation task. It is concluded that the hamsters functionally adapt to hypergravity, which leads to an altered performance of several tasks. The condition continues after 4 months of normal gravity.

In chapter 7 the vestibular function and otoconia morphology is studied in adult hamsters (3 months old) subjected to either prolonged hypergravity or normal gravity for 2 month-s. Locomotion and swimming under light conditions was normal-. Equilibrium maintenance was severely disturbed. Hypergravity hamsters were also less susceptible to rotations and the air-righting reflex was severely disturbed. Finally, 5 of 8 hypergravity hamsters had to be saved from drowning when swimming in total darkness.

Histological examination (with EDAX and SEM) of the utricular otoconial layers afterwards showed no chan-ges in -calcium content, size, shape and size distribution of the otoconia. It is concluded that adult hamsters adapt to hypergravity. This leads to problems in normal functioning when the animals are tested under normal gravity conditions, especially in tasks in which sensory input of the vestibular system is the dominant source for orientation. These disturbances are more severe in adult hamsters than in young ones tested in the previous experiments (chapter 6), so it is assumed that age is a factor for adaptation to altered gravity conditions.

In chapter 8 the relation between hyper-gravity and structural adaptation of otoconia was studied in hamsters conceived and born in a centrifuge. Five groups of hamsters were formed: group I) 1 month in 2.5 G; group II) 5 months in 2.5 G and 4 month-s in 1 G; group III) 1 month in 2.5 G and 8 months in 1 G; group IV) young control hamsters (1 month old, born in 1 G); and group V adult control hamsters (9 months old, born in 1 G). Histological study of the otoconial layers (with EDAX and SEM) showed similar -calcium content, size and shape in utricular and saccular otoconia- in all groups. The utricular otoconial size classes, large, medium-sized and small were different. The area with small otoconia increased in group I. In group II, the- large otoconial area decreased and the medium-sized one increased. In group III, the large otoconial area decreased- and the medium-sized one increased. For age-related effects, group I showed an increased area of large otoconia and a decreased medium-sized one compared to groups II- and III, while no differences were found between young and adult control animals-.

The conclusion is that hypergravity during formation of otoconia does not affect calcium content, size or shape, but changes relative size of the areas with large, medium-sized or small otoconia and- the development of these areas. This results in a structural adaptation to hypergravity.

In chapter 9 the vestibular function of the hamsters of chapter 8 and of a group of hamsters which were subjected to rotation in the center of the centrifuge (Rotation hamsters) is discussed. Locomotion, swimming, air-righting and the susceptibility to rotations was examined during this period. Hamsters conceived and born in the centrifuge and afterwards living in either normal or hyper-gravity had no disturbances in gait and locomotion. Their swimming ability (drowning, circling and decreased speed of swimming) was severely disturbed. Furthermore, the hamsters living in hypergravity showed less treadmill activity during 2.5 G, had balance disturbances, showed less rearing activity, were less susceptible to rotatory accelerations, and showed fewer correct air-rightings than the other groups. After 3 months of normal gravity, these differences between groups disappeared except for the disturbed swimming ability and the number of correct air-righting responses. The hamsters subjected to rotation without the increased G-load had only balance difficulties.

It is concluded that the structural adaptation to hypergravity in the otoconial layers of the otolith organs (described in chapter 8) is one of the causes for the behavioural disturbances found in hamsters prenatally developed in hypergravity. Furthermore, hypergravity and rotation have a different effect on vestibular evoked behaviour.

Finally, in chapter 10 the findings of all experiments, discussed in the previous chapters, are evaluated. It is concluded that prenatal development in hypergravity leads to structural alterations of the otolith organ while exposure to hyper-gravity after birth does not result in alterations (at least not in the otoconial layer). These alterations change the functioning of the vestibular system resulting in disturbances in vestibular controlled behaviour. Some of these disturbances are persistent and do not disappear after the hamsters returned to normal gravity. Exposure to hyper-gravity after birth results in less severe behavioural disturbances. Moreover, these disturbances are the result of the increased gravity force and not of the rotational forces which are present during continuous centrifugation. Some suggestions for further investigations of the effect of hypergravity on function and structure of the peripheral vestibular system are presented at the end of the chapter.

11.2 Samenvatting

Hoofdstuk 1 beschrijft het doel van deze dissertatie: het onderzoek naar het effect van langdurig verhoogde zwaartekracht (hypergraviteit) op de functie (vestibulair aangestuurd gedrag) en structuur (de otoconia laag van de otoliet organen) van het vestibulair systeem. De term bewegingsziekte en vooral ruimteziekte (een vorm van bewegingsziekte) worden nader toegelicht vooral wat betreft definities, symptomen en etiologie. Verder komt de rol van het vestibulair systeem in het ontstaan van ruimteziekte en in bewegingsziekte voortvloeiende uit langdurige blootstelling aan een verhoogde zwaartekracht in een centrifuge aan de orde.

In hoofdstuk 2 wordt het vestibulair systeem beschreven waarbij de nadruk ligt op het perifeer vestibulair systeem. Dit bestaat uit de otoliet organen en de half cirkel-vormige kanalen. Op de ontwikkeling en fysiologie van deze zwaartekracht gevoelige organen wordt uitvoerig ingegaan, vooral wat betreft de otoconia laag. Ook het centrale vestibulair systeem wordt in het kort besproken.

In hoofdstuk 3 worden de effecten geëvalueerd van langdurige hypergraviteit op de anatomie en lichaamsfunkties van kleine dieren, te weten: lichaams gewicht, bot en spierweefsel, het cardiovasculair systeem, voortplanting en het vestibulair systeem. Wat betreft het vestibulair systeem wordt extra aandacht gegeven aan het effect van hypergraviteit op het gedrag van dieren na terugkeer in normale zwaartekracht.

In de literatuur wordt gemeld dat langdurige hypergraviteit leidt tot een verlaagd lichaamsgewich,t hetgeen vooral wordt veroorzaakt door een sterke verlaging van de hoeveelheid lichaamsvet. De verhoogde zwaartekracht conditie is ook verantwoordelijk voor structurele veranderingen in de dijbenen. Deze zijn dikker, korter, krijgen een grotere dichtheid en kunnen zo een grotere buiging weerstaan dan dijbenen van controle dieren. Analyse van spiervezels toont aan dat tijdens hypergraviteit de snel vermoeibare (FOG) vezels worden omgezet in vezels, die minder snel vermoeid raken (SO vezels) om zo de hogere mechanische stress te overleven. De hogere energie nodig voor het leven in hypergraviteit leidt tot een afname van het aantal mitochondria en een toename van lipofuscine in het myocardium en de lever. Deze veranderingen lijken erop te wijzen dat deze organen sneller verouderen onder hypergraviteit dan onder normale zwaartekracht. Ook wordt een toename gevonden in de vorming van rode bloedcellen (erythropoëse). Dit wordt veroorzaakt door een verhoging in de metabolische processen gedurende hypergraviteit.

De embryonale ontwikkeling onder hypergraviteit leidt tot deformaties in de embryos hetgeen resulteert in een verminderd aantal levende pups. Dit aantal neemt nog meer af doordat de moeder de jongen niet verzorgt of doordat een aantal jongen de hypergraviteitsconditie niet kunnen overleven.

In de otoliet organen leidt langdurige hypergraviteit tot een herverdeling van de sacculaire otoconia in de richting van de zwaartekracht en een dikker membraan rondom de sacculus. In de laterale vestibulair kern en de cerebellaire nodulus en het vestibulair aangestuurd gedrag van deze dieren worden ook verschillen gevonden tussen HG en controle ratten.

Hoofdstuk 4 beschrijft het pilot experiment met als doel verschillen aan te tonen in perceptief-motorische vaardigheden tussen hamsters levend in hypergraviteit (2.5 G) en hamsters levend onder normale zwaartekracht condities. Gedurende 4 maanden zijn testen gedaan, waarmee het gedrag van deze hamsters is onderzocht, te weten: evenwichtshandhaving, zwemmen en open veld gedrag. Het bleek dat deze testen nuttig zijn voor het detecteren van verschillen in perceptief-motorische vaardigheden tussen beide groepen. Zo hebben de hypergraviteit-hamsters meer moeite met het lopen over smalle balkjes en het oriënteren tijdens zwemmen. Verder vertonen ze minder locomotie tijdens het open veld onderzoek. Geen verschillen zijn waargenomen in het open veld onderzoek wat betreft poetsgedrag, het staan op de twee achterpoten en het aantal keren dat ze defaeceren. Deze bevindingen tonen aan dat hamsters levend in hypergraviteit de overgang van 2.5 G naar 1 G niet als stressvol ervaren, hoewel de uitvoering van de perceptief-motorische taken vooral gedurende de eerste testweken verslechtert.

In hoofdstuk 5 is het effect van hypergraviteit op de otoconia laag van de maculus utriculi en de maculus sacculi onderzocht. De hamsters werden in de centrifuge geplaatst onder een verhoogde zwaartekracht conditie van 2.5 G en verbleven hierin gedurende 6 maanden. Naderhand is de calcium concentratie, de grootte, vorm en de distributie van de otoconia bepaald door middel van elementen analyse (Energy Dispersive X-ray Element Analysis, EDAX) en scan elektronen microscopie (SEM). Er zijn geen verschillen gevonden tussen hypergraviteit-hamsters en controle dieren in bovengenoemde variabelen. Geconcludeerd kan worden dat op het niveau van de otoconia geen structurele adaptatie aan de hypergraviteit plaats heeft gevonden, tenminste niet in hamsters die zijn blootgesteld aan hypergraviteit, nadat het vestibulair systeem volgroeid was.

In hoofdstuk 6 wordt de invloed van hypergraviteit op het gedrag van de hamsters uit hoofdstuk 5 besproken. De motoriek van de hypergraviteit-hamsters is bijna niet veranderd; locomotie bleek normaal te zijn en ook zwemmen was voor deze hamsters geen probleem. Wel hebben ze meer moeite met het handhaven van evenwicht dan controle dieren gedurende de eerste 3 maanden van het onderzoek. Ook zijn significante verschillen aangetoond in het oriënteren tijdens zwemmen en het wisselen van looprichting gedurende de rotatietaak. Na zes maanden is de helft van beide groepen hamsters nog 4 maanden verder getest terwijl beide groepen leefden in normale zwaartekracht conditie. De gevonden verschillen in het oriënteren tijdens zwemmen en het wisselen van looprichting gedurende de rotatietaak bleven bestaan. De conclusie is dat de hamsters functioneel adapteerden aan de verhoogde hypergraviteit. Dit leidt tot een verandering in de uitvoering van verschillende taken. Deze adaptatie blijft zelfs na een verblijf van 4 maanden in normale zwaartekracht ongewijzigd.

Hoofdstuk 7 handelt over het effect van hypergraviteit op het gedrag en de structuur van de otoliet organen van hamsters die op volwassen leeftijd (3 maanden oud) gedurende 2 maanden aan deze conditie werden blootgesteld. De resultaten laten geen verschillen zien tussen beide groepen wat betreft locomotie en zwemmen in licht. Het balanceren op de evenwichtsbalken blijkt daarentegen ernstig verstoord te zijn. Ook in dit onderzoek vertonen hamsters, die worden blootgesteld aan hypergraviteit, een verminderde gevoeligheid voor rotaties. De air-rightings reflex (het landen op 4 poten) was bij de hypergraviteit- hamsters vaak afwezig en daarbij moesten 5 van de 8 hamsters gered worden van verdrinking tijdens het zwemmen in het donker. Histologisch onderzoek laat geen verschillen zien in calcium concentratie, grootte, vorm en distributie van de otoconia. Geconcludeerd kan worden dat deze volwassen hamsters adapteren aan de hypergraviteits conditie. Dit heeft tot gevolg dat ze problemen hebben met normaal perceptief-motorisch functioneren gedurende normale zwaartekracht, vooral tijdens taken waarin formatie van het vestibulair systeem als belangrijkste informatie bron beschouwd kan worden. Ook is het zo dat sommige verschillen groter zijn in deze groep hamsters dan in de jonge hamsters van het vorige hoofdstuk (hoofdstuk 6), zodat verondersteld kan worden dat leeftijd een belangrijke rol speelt in het adapteren aan veranderde zwaartekracht condities.

In hoofdstuk 8 wordt de relatie onderzocht tussen hypergraviteit en structurele adaptatie van otoconia in hamsters die werden verwekt en geboren in hypergraviteit. Vijf groepen werden gevormd: groep I) 1 maand in 2.5 G; groep II) 5 maanden in 2.5 G en 4 maand-en in 1 G; groep III) 1 maand in 2.5 G en 8 maanden in 1 G; groep IV) jonge controle hamsters (1 maand oud, geboren in 1 G) en groep V) volwassen controle hamsters (9 maanden oud, geboren in 1 G). Histologisch onderzoek van de otoconia laag (met EDAX en SEM) laat tussen de groepen geen verschillen zien in calcium concentratie, grootte en vorm van de otoconia van de utricle en sacculus. Wel zijn verschillen gevonden in de gebieden van de otoconia laag van de utriculi met otoconia van verschillende klassegrootte (grote, gemiddeld en kleine otoconia). In groep I blijkt het gebied met kleine otoconia kleiner te zijn dan bij de controle groep van dezelfde leeftijd (groep IV). In groep II is het gebied met grote otoconia dan in groep V. In groep III is het gebied met grote otoconia kleiner en het gebied met gemiddelde otoconia groter dan bij de controle groep V. Wat betreft leeftijd gerelateerde effecten toont groep I een groter gebied met grote otoconia en een kleiner gebied met middelgrote otoconia dan groep II en III, terwijl tussen jonge en oude controle dieren (groep IV en V) geen verschillen zijn gevonden.

Geconcludeerd kan worden dat hypergraviteit gedurende de formatie van de otoconia geen effect heeft op de calcium concentratie, vorm en grootte van de otoconia maar wel een structurele adaptatie tot gevolg heeft met betrekking tot de distributie van deze otoconia in bepaalde gebieden en de ontwikkeling van deze gebieden.

In hoofdstuk 9 wordt het vestibulair functioneren bestudeerd van de hamsters uit hoofdstuk 8 en een groep hamsters blootgesteld aan rotatie in het midden van de centrifuge (geen zwaartekrachtsverhoging). Locomotie, zwemmen, air-righting en gevoeligheid voor rotaties zijn getest gedurende de periode dat de hamsters leefden in hypergraviteit en in de periode die ze onder normale zwaartekrachtcondities doorbrachten. Dieren die in hypergraviteit zijn verwekt en geboren lieten geen veranderingen zien in looppas en locomotie. Zwemmen gaf problemen bij deze hamsters (verdrinkingsgevaar, cirkelen, langzamere zwemsnelheid). Daarnaast hadden deze hamsters een verminderde tredmolen activiteit, evenwichtsstoornissen tijdens het lopen over de balken, minder rearing gedrag in het open veld, verminderde gevoeligheid voor rotaties en een afname van het aantal correcte air-rightings, wanneer hun resultaten werden vergeleken met die van de andere groepen. Na 3 maanden in normale zwaartekracht te hebben geleefd, verdwenen de meeste verschillen met uitzondering van het zwemmen en het aantal correcte air-righ-tings. De hamsters die alleen aan rotatie waren blootgesteld hadden slechts evenwichtstoornissen tijdens het lopen over de balken.

Geconcludeerd kan worden dat de structurele adaptatie van het perifere vestibulaire systeem (beschreven in hoofdstuk 8) een van de oorzaken is voor de gedragsveranderingen in hamsters die verwekt en geboren zijn in hypergraviteit. Verder bleek dat hypergraviteit en rotatie een verschillend effect hebben op vestibulair aangestuurd gedrag.

In hoofdstuk 10 worden de resultaten van de experimenten uit de eerdere hoofdstukken besproken. Geconcludeerd kan worden dat hypergraviteit tijdens de embryonale ontwikkeling leidt tot veranderingen in de otoliet organen terwijl het blootstellen aan hypergraviteit na de geboorte geen veranderingen tot gevolg heeft (tenminste niet in de otoconia laag). Deze veranderingen wijzigen het functioneren van het vestibulair systeem, hetgeen resulteert in verstoringen van vestibulair gecontroleerd gedrag. Sommige van deze verstoringen zijn van blijvende aard en verdwijnen niet wanneer de hamsters voortleven in normale zwaartekracht. Blootstelling aan hypergraviteit na de geboorte resulteert in minder ernstige verstoringen van gedrag. Bovendien worden deze stoornissen veroorzaakt door de verhoogde zwaartekracht en niet door de aanwezige rotatie versnellingen tijdens het centrifugeren. Aan het einde van dit hoofdstuk worden een aantal suggesties gedaan voor verder onderzoek naar het effect van hypergraviteit op de functie en de structuur van het perifeer vestibulair systeem.