NL.1 ALGEMENE SAMENVATTING EN CONCLUSIE

Al vanaf het begin van de bemande ruimtevaart werd er gespeculeerd dat de microzwaartekracht-omgeving in de ruimte verscheidene effecten zou hebben op het menselijk lichaam. Naast de verhoogde kosmische straling en verandering in de distributie van lichaamsvloeistoffen, zou de overbodigheid van de steunfunctie van het skelet in de ruimte één van de veronderstelde veranderingen zijn. Galilei (1564-1624)(1) suggereerde reeds een relatie tussen de mechanische belasting en vorm van het skelet. Veel later, in 1836, beschreef Ward(6) de ruimtelijke verdeling van botbalkjes in de humane dijbeenkop en suggereerde dat dit gerelateerd zou zijn aan de steunfunctie voor mechanische belasting. Meer dan een halve eeuw later, in 1892, publiceerde Wolf zijn boek 'Das Gezetz der Transformation der Knochen', waarin hij een 'wet' postuleerde die stelde dat de vorm van de interne structuur van het bot een afspiegeling is van de mechanische belasting dat dit bot ooit ondervonden heeft. Sindsdien hebben veel studies met intacte dieren en mensen (in vivo) de relatie tussen structuur of sterkte en mechanische belasting aangetoond. Maar enkele experimenten waren gewijd aan de reactie van geisoleerde skeletweefsels en cellen (in vitro) op aangebrachte belasting. Glucksmann was, zo'n 50 jaar geleden, één van de eersten die aantoonde dat skeletweefsel reageert op mechanische belasting in weefselkweek condities.(2) Klein-Nulend et al. paste, beter gecontroleerde en gedefinieerde, krachten toe op foetaal skeletweefsel in kweek.(3,4) Zij bestudeerden de invloed van mechanische belasting, toegebracht door middel van een intermitterende hydrostatische druk (intermittent compressive force: ICF), op de ontwikkeling van foetale muizepijpbeentjes en schedeldakjes. Door gebruik te maken van dit systeem hebben ze aangetoond dat hydrostatische druk in muizepijpbeentjes resulteert in een verhoogde mineralisatie en een verlaagde mineraalresorptie in vergelijking met de controle, niet belaste kweken. Gebaseerd op deze resultaten hebben we dit weefselkweeksysteem dusdanig aangepast, dat dit te gebruiken was voor microzwaartekrachtexperimenten.

Waarom microzwaartekrachtexperimenten ?

Op Aarde is het alleen maar mogelijk de mechanische belasting in een weefselkweek conditie te verhogen, in vergelijking met controle condities. In het systeem dat door Klein-Nulend et al. werd gebruikt, werd ook een verhoogde belasting op pijpbeentjes aangebracht.(3,4) Echter, tijdens een ruimtevlucht, in bijna-gewichtloze toestand, zijn er nagenoeg geen mechanische krachten werkzaam op materie. Door foetale muizepijpbeentjes te kweken onder bijna-gewichtloosheid of microzwaartekrachtcondities, zouden we in de ruimte de invloed moeten kunnen zien van een heel lage mechanische belasting op groei en differentiatie. Door gebruik te maken van twee verschillende modellen van fasen in foetale botontwikkeling, 16 en 17 daags oude middenvoetsbeentjes, kunnen we wellicht de twee processen in bot, de vorming van mineraal en de afbraak ervan, afzonderlijke bestuderen. Tegelijkertijd kan ook de normale lengtegroei bestudeerd worden. Omdat dit een weefselkweekexperiment is, is het mogelijk een oud enigma, dat al bestaat sinds de eerste gegevens over bot in relatie tot ruimtevaart bekend werden, op te helderen, zoals beschreven in hoofdstuk 1: Is de verminderde botmassa en/of sterkte welke gevonden wordt na een ruimtevlucht het resultaat van een verminderde steunfunctie van het skelet, of is het verlies aan bot het resultaat van een verhoogde stress-hormoonspiegel of andere veranderingen in de homeostasis als een gevolg van die ruimtevlucht? Door gebruik te maken van de modelsystemen van deze pijpbeentjes kunnen we de hypothese testen dat de effecten die gezien worden in botten na ruimtevluchten, ten minste ten dele, een gevolg zijn van een gebrek aan mechanische belasting.

Het testen van een hypothese betekend het uitvoeren van experimenten, maar zeker in ruimtevaartonderzoek geldt de uitdrukking: 'makkelijker gezegd dan gedaan'. Na de euforie dat er de mogelijkheid werd geboden om een ruimtevaartexperiment te doen, volgde de lange en moeizame weg van het omzetten van alledaagse gangbare handelingen of instrumenten naar 'ruimtevaart gekwalificeerde procedures en apparatuur'.

Wanneer we aan de ruimte en ruimtevaart denken, komen er vaak drie dingen in ons op: de gewichtloosheid, het luchtledige en de bijzonder lage temperaturen. De laatste twee fenomenen waren echter niet van belang, daar de experimenten die in dit proefschrift beschreven zijn, uitgevoerd werden binnenin een ruimteschip, waarin de atmosfeer vergelijkbaar is met onze Aardse omgevingstemperatuur, samenstelling en druk. De eerste eigenschap, gewichtloosheid, of beter gezegd, bijna-gewichtloosheid (zie appendix B), is ook in het rond de Aarde zwevend ruimteschip aanwezig, en dit is juist de reden waarom onderzoekers gebruik maken van de ruimte. Het is ook juist deze bijna-gewichtloze omgeving die vereist dat allerlei dingen, die zo gewoon zijn in onze dagelijkse wereld van zwaartekracht, herontworpen moeten worden om ze in bijna-gewichtloosheid of microzwaartekracht in de ruimte te kunnen gebruiken. Naast microzwaartekracht zijn er ook de lanceer- en tijdlijnbeperkingen die bij ruimtevaartexperimenten gelden. De apparatuur en de biologische monsters die gebruikt worden, moeten zodanig zijn dat ze de ruige lanceringscondities en vertragingen bij het opstarten van het experiment moeten kunnen doorstaan. Dit in ogenschouw nemend, is het verbazingwekkend dat het alleen voor de gebruikte apparatuur verplicht is aan te tonen dat het deze condities kan doorstaan, dit geldt echter niet voor het biologisch materiaal.

In hoofdstuk 2 worden een aantal van deze beperkingen behandeld, o.a. het converteren van normale weefselkweektechnieken en materialen naar ruimtevaart gekwalificeerde procedures en apparatuur. Vervolgens wordt ook aangetoond hoe we het uitstel van de begintijd van een experiment hebben kunnen overbruggen. De omgeving waarin cellen en weefsels groeien is een belangrijke factor in weefselkweek. De meeste zoogdiercellen vereisen een temperatuur van 37°C en een 5% CO2 in lucht gasfase. Het eerste vereiste werd verzorgd door de Biorack faciliteit aan boord de Space Shuttle, waarin het experiment werd uitgevoerd. De 5% CO2 in lucht gasfase, echter, werd niet door deze faciliteit geleverd. Pas nadat een aantal alternatieve kweektechnieken, die niet op CO2 gebaseerd waren, afgekeurd werden, is er besloten om voor dit experiment een 5% CO2 in lucht gasfles te gebruiken. Een ander probleem was de tijdsoverbrugging tussen de uiteindelijke voorbereidingen van een experiment en de feitelijke start ervan in de ruimte. Deze tijd is nodig voor overdrachtprocedures (vervoer naar de lanceerplaats, de inbouw, en de lancering) en het uiteindelijk opstarten van het experiment tijdens de vlucht. Gelukkig bleek dat, door het weefsel gewoonweg bij kamertemperatuur te houden, het mogelijk was deze 24 uur tijdspanne tussen experiment integratie en feitelijke uitvoering te overbruggen. Ook konden de 24 wells kweekplaten waarin de middenvoetsbeentjes normaal gekweekt worden, vervangen worden door polyethyleen kweekzakjes, zonder de in vitro kweekeigenschappen te veranderen.

Door verhoging van de gasfasedruk in de Type-I containers worden de pijpbeentjes onderworpen aan hydrostatische druk. Klein-Nulend et al. (4) hebben reeds aangetoond dat, door de druk boven het kweekmedium te verhogen, er een mechanische belasting ontstaat, bekend als continue hydrostatische druk (Continuous compressive force, CCF). Het is aangetoond dat CCF een anabool effect heeft op de mineralisatie van middenvoetsbeentjes. Een andere vraag die we onszelf stelden was of, als microzwaartekracht een effect heeft op foetale muizepijpbeentjes wat vergelijkbaar is met die bij immobiliteitsosteoporose (een verlaagde mineraaldichtheid), het dan mogelijk zou zijn deze effecten op te heffen door een mechanische belasting toe te dienen door de gasfasedruk in de containers te verhogen in microzwaartekracht omstandigheden. Helaas, ondanks dat de hardware in de vlucht perfect functioneerde, en om voor ons onbekende redenen, is dit deel van het experiment mislukt. We konden het CCF effect niet in controle kweken dupliceren, en kunnen derhalve geen conclusies trekken in relatie tot de gestelde hypothese.

Hoewel apparatuurontwikkeling cruciaal is en het ook een interessant onderdeel is in de voorbereiding op een ruimtevaart experiment, zijn de uiteindelijke microzwaartekrachtresultaten het belangrijkste doel. Zoals reeds eerder gesteld, was onze reden om in de ruimte een experiment uit te voeren onder microzwaartekrachtomstandigheden, het testen van de hypothese dat de negatieve effecten die in vivo in humaan en rattebot na een ruimtevlucht gevonden worden, te wijten zijn aan het ontbreken van mechanische belasting op het skelet. Om dit te testen hebben we twee iets verschillende in vitro botmodelsystemen gebruikt. Ten eerste, zijn er 16-daags oude (ED16) foetale muizepijpbeentjes (middenvoetsbeentjes) gebruikt om, hoofdzakelijk, matrix mineralisatie te bestuderen. In een tweede model, een anderhalve dag ouder, 17.5-daags (ED17.5) botje, bestudeerden we osteoclastische matrixafbraak, waarvan de procedure in meer detail beschreven staat in hoofdstuk 3. In aansluiting op de data van mineraalmetabolisme, zijn er ook de gegevens over groei, glucose verbruik en collageen aanmaak verkregen. Doordat we de ED16 en ED17.5 pijpbeentjes voor het experiment 'Bones' in de Biorack faciliteit van de Europese riumtevaart organisatie ESA, tijdens het eerste internationale microzwaartekrachtlaboratorium (IML-1, STS-42, lancering 22 januari 1992) Shuttle vlucht hebben gebruikt, hebben we kunnen aangetonen dat microzwaartekracht inderdaad een invloed heeft op mineraal metabolisme in pijpbeentjes in weefselkweek. Bijna-gewichtloosheid resulteerde in een gereduceerde mineralisatie en gereduceerde glucose verbruik. Tevens was de osteoclastische mineraal resorptie verhoogd. Algemene groei, afgemeten aan de toename van de totale lengte, was niet of nauwelijks verminderd onder microzwaartekracht, terwijl collageen aanmaak niet was veranderd. Alle microzwaartekracht effecten waren vergeleken met de monsters van de aan boord aanwezige 1×g centrifuge. Er wordt in hoofdstuk 3 ook ingegaan waarom de 1×g centrifuge aan boord de beste controle is voor dit soort ruimtevaartexperimenten.

Een gedeelte van de uitkomsten van de IML-1 vlucht werd geverifieerd gedurende een Russische missie. Hoofdstuk 4 beschrijft de experimenten voor het testen van de apparatuur voor deze onbemande vlucht. Hoofdstuk 5 beschrijft de opzet en de resultaten van deze Cosmos-2224 missie (Bion-10), die op 29 december 1992 gelanceerd werd. De ED17 middenvoetsbeentjes die voor deze experimenten gebruikt zijn, werden gekweekt in volledig automatische weefselkweekapparaatjes, zogenaamde plungerboxen. In een ietwat ander experimentprotocol dan gebruikt is voor IML-1, werden ED17 botjes gebruikt om mineralisatie en lengtegroei te bestuderen. Ook dit experiment resulteerde in een verminderde mineralisatie in pijpbeentjes onder microzwaartekracht condities. In beide microzwaartekrachtstudies reageren foetale muizepijpbeentjes met een significante verlaging van matrix mineralisatie op een bijna gewichtloze omgeving, ondanks het feit dat er twee totaal verschillende typen apparatuur en tijdlijnen gebruikt werden.

Tijdens de voorbereidingen voor de Russische onbemande Bion-10 vlucht moesten een aantal modificaties aan de apparatuur gebracht worden, welke beschreven staan in hoofdstuk 4. Speciale weefselkweekapparatuur die reeds ontwikkeld was voor eerdere ruimtevaartexperimenten, moest aangepast worden aan onze behoeften. Een aantal technische veranderingen werden aangebracht als gevolg van biologische testen. Het bleek dat het aanvankelijk gekozen materiaal, polysulfon (PSU), niet bruikbaar was voor mineralisatiestudies van zowel botjes als beenmerg kweken, die gepland waren voor deze ruimtevaartstudie. Studies aan het Vlaamse Instituut voor Technologisch Onderzoek (VITO) en in ons laboratorium, leerden dat differentiatie van skeletweefsel en cellen niet mogelijk was als deze in contact zijn met stoffen afkomstig uit PSU. Typische indicatoren voor botgroei en ontwikkeling zoals alkalische fosfatase, collageen aanmaak en matrix mineralisatie waren sterk verminderd of zelfs volledig afwezig in kweekjes met polysulfon plastics. Verbazingwekkend genoeg, waren er geen effecten op de proliferatie, gemeten met 3H-thymidine inbouw in osteoblastachtige cellen, of toename in totale lengte van middenvoetsbeentjes. Uiteindelijk, is er voor polyethylenterephthalate (PETP) als basismateriaal gekozen voor de constructie van de weefselkweekmodule te gebruiken voor het Bion-10 experiment, in plaats van polysulfon.

Polysulfon polymeren worden ook gebruikt in orthopedische implantaten. Het bleek dat de voorbereidende experimenten voor deze ruimtevlucht van interesse waren voor de orthopedische praktijk. De resultaten van de biocompatibiliteitstesten pleiten tegen het gebruik van polysulfon dat in contact staat met botweefsel, zoals wordt gebruikt in botvervangende therapieën.

In aanvulling op de microzwaartekrachtexperimenten, worden in hoofdstuk 6 de resultaten beschreven van experimenten met foetale pijpbeentjes die onder een verhoogde zwaartekracht gekweekt werden. Groei en mineraal metabolisme onder verhoogde versnellingen, c.q. hyperzwaartekracht, in ED16 en ED17 middenvoetsbeentjes werden bestudeerd. De meeste van deze experimenten zijn uitgevoerd in een zelfgemaakte prototype weefselkweekcentrifuge, terwijl voor de voorbereidende experimenten, uitgevoerd aan de Universiteit van Texas in Houston, een meer geavanceerde weefselkweekcentrifuge werd gebruikt.

In beide experimenten is aangetoond dat een verhoogde zwaartekracht in het bereik van 2.2 tot 3.2×g resulteerde in een verhoogde matrix mineralisatie in ED16 middenvoetsbeentjes. De totale lengte, als indicatie voor algemene groei, was ook verhoogd in 2.2×g-ED16 botjes in vergelijking met 1.0×g controles. 17 Daagse 45Ca gelabelde botjes, gebruikt voor mineraal afbraak studies, lieten zien dat onder 2.2×g het calciumverlies verhoogd was, wat indicatief is voor een verhoogde osteoclastische activiteit.

Figuur 7.1 Een schematische weergave van de verschillende parameters van skeletgroei en differentiatie, gebaseerd op de gegevens van de experimenten beschreven in dit proefschrift. Onder microzwaartekracht is er een verlaging in glucoseverbruik en mineralisatie, en een vermoedelijke vertraagde lengtegroei. Mineraalafbraak is verhoogd onder microzwaartekracht. Lengtegroei is verhoogd onder hyperzwaartekracht-condities, evenals mineraalafbraak, in vergelijking met 1×g controles.

De resultaten van hoofdstukken 3, 5 en 6 kunnen gecombineerd worden om zo een beeld te krijgen van de effecten van microzwaartekracht en verhoogde zwaartekracht op de ontwikkeling van foetale muizepijpbeentjes. Figuur 7.1 is een schematische weergave van deze microzwaartekracht en hyperzwaartekracht resultaten. In reactie op zwaartekracht, vertonen mineralisatie en groei een continuüm door het 1×g referentiepunt heen. Beide zijn verminderd onder microzwaartekracht en verhoogd onder verhoogde zwaartekracht. Dit in tegenstelling tot osteoclastische mineraalafbraak, die verhoogd is onder zowel micro- als hyperzwaartekracht condities. Voor collageen aanmaak en glucose verbruik zijn alleen twee waarden beschikbaar, microzwaartekracht en 1×g. Hyperzwaartekracht experimenten zijn nodig om deze lijn te verlengen.

De niet-lineaire reactie op mineraalafbraak zou kunnen betekenen dat hier twee processen een rol spelen. Onder microzwaartekracht zou de verhoogde afbraak een gevolg kunnen zijn van het gemis van mechanische krachten, hetgeen botverlies veroorzaakt. In geval van hyperzwaartekracht zou de verhoging van de mineraalresorptie een gevolg kunnen zijn van de continue druk op deze foetale muizepijpbeentjes.

Parameters zoals glucoseverbruik en collageenaanmaak moeten nog gemeten worden onder hyperzwaartekracht condities. Om toekomstige hyperzwaartekrachtexperimenten mogelijk te maken is er een nieuwe centrifuge gebouwd. Een studie door van Loon en medewerkers beschrijft de inventarisatie van eisen en de daaropvolgende bouw van een middelgrote centrifuge voor versnellingsonderzoek (MidiCAR).(Appendix A and ref. 5) De realisatie van dit project is tot stand gekomen door een nauwe samenwerking van verschillende in zwaartekracht geïnteresseerde wetenschappers, industrie en de Stichting Ruimteonderzoek in Nederland (SRON). Het apparaat voorziet toekomstige experimentatoren van een zeer goed gecontroleerd en gebruiksvriendelijk apparaat om hyperzwaartekracht experimenten uit te voeren. Alhoewel de resultaten van deze hyperzwaartekracht studies niet vanzelfsprekend het spiegelbeeld van microzwaartekracht gegevens hoeven te zijn (zie figuur 7.1), kunnen ze wel bijdragen tot onze kennis van cellulaire processen in relatie tot versnellingen c.q. mechanische krachten, op het skelet of op verschillende andere weefsels en cellen. Aan de andere kant, is de microzwaartekrachtomgeving een unieke plaats om de effecten van bijna afwezige mechanische krachten op foetale botgroei en differentiatie in vitro te bestuderen. Hierdoor leveren zowel microzwaartekracht als hyperzwaartekracht experimenten een bijdrage aan de opheldering van het mechanotransductiesysteem in skeletale cellen en weefsels. Derhalve dragen zwaartekrachtstudies bij aan ons begrip van de wet van Wolff op cel- en moleculair niveau.

Verschillende processen zijn onder microzwaartekracht anders in vergelijking met een 1×g conditie op Aarde of onder hyperzwaartekracht condities (Appendix B). Het was zeer verrassend te constateren dat er, zelfs in het gebied van wetenschap die zich bezighoud met zwaartekracht, zeer weinig bekend is over de invloed van verschillende fysische factoren op biologische systemen. Het is reeds lang bekend dat convectie, hydrostatische druk of Coriolis krachten beïnvloed worden door versnellingen c.q. zwaartekracht. Er zijn verschillende experimenten uitgevoerd om de invloed van een verlaagde zwaartekracht op cellen en weefsels te inventariseren, maar deze studies hebben niet het onderscheid belicht tussen primaire en secundaire effecten van zwaartekracht. Men moet zich realiseren dat de effecten waargenomen tijdens ruimtevaartexperimenten, indirect kunnen zijn, als gevolg van veranderingen in omgevingscondities van de weefsels, in tegenstelling tot directe effecten als gevolg van microzwaartekracht op cellen. Appendix B geeft een korte introductie over fysische factoren die van belang kunnen zijn voor microzwaartekracht en hyperzwaartekracht experimentatoren. Toekomstige experimenten zouden de invloed van deze processen op biologische systemen systematisch moeten testen. Het merendeel van deze experimenten kunnen op Aarde worden uitgevoerd met een incidentele verificatie onder microzwaartekracht condities. Alleen dan kunnen directe (micro-) zwaartekrachteffecten onderscheiden worden van secundaire effecten ten gevolge van veranderende omgevingsfactoren. Deze vragen pleiten sterk voor een toekomstige samenwerking en integratie van de diciplines biologie en fysica. Ruimtevaartexperimenten worden (vaak in dezelfdse missie) uitgevoerd door beide wetenschappelijke disciplines. Deze gemeenschappelijke interesse zou versterkend kunnen werken bij het toekomstig begrip van het gedrag van cellen in de ruimte, het gebied van zwaartekracht biofysica.

NL.2 CONCLUSIE

Concluderend, dit proefschrift beschrijft, voor het eerst, een samenhangende studie over de effecten van verschillende versnellingen, variërend van bijna gewichtloosheid tot een verhoogde zwaartekracht van meer dan 3×g, op het mineraalmetabolisme van pijpbeentjes in weefselkweek. De botjes reageren op het wegvallen van de zwaartekracht met een verlaagde mineralisatie en glucoseverbruik en een verhoogde mineraalresorptie, terwijl algemene groei en collageen aanmaak, statistisch gezien, niet beïnvloed worden. Verhoogde versnellingen, tot 2.2×g, resulteren in verhoogde groei, toegenomen mineralisatie, evenals een toegenomen mineraalresorptie. Verlaging van de mechanische belasting leidt tot een verminderde botmineraaldichtheid terwijl het verhogen van de belasting resulteert in een verhoogde mineralisatie. Deze resultaten laten zien dat de ideeën van Wolff ook van toepassing zijn op foetale pijpbeentjes onder diverse zwaartekrachtcondities.

Toekomstige Aardse hyperzwaartekracht-, in combinatie met hypozwaartekrachtexperimenten in de ruimte, zouden gewijd moeten zijn aan de zoektocht naar het mechanosensorsysteem in skeletweefsel en cellen. Er is meer onderzoek nodig op het gebied van secundaire boodschappermoleculen, signaal overdracht, rek geactiveerde ionkanalen, membraanpotentialen en de rol van het celskelet. Op den duur zullen de studies naar het gedrag van de cel in reactie of mechanische belasting bijdragen aan de kennis en begrip van het ziekteverloop en mogelijke behandeling van botontkalking ten gevolge van verminderde beweging, c.q. immobiliteitsosteoporose, en misschien andere biomechanisch gerelateerde aandoenigen.

NL.3 REFERENTIES

1Galileo G. Two new sciences. In; "The second day". Translated by Stillman Drake, The University of Wisconsin Press 109-146, 1974.
2 Glucksmann A. Studies on bone mechanics in vitro. II. The role of tension and pressure in chondrogenesis. Anat. Rec. 73, 39-56, 1942.
3 Klein Nulend J., Veldhuijzen J.P., Burger E.H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1-9, 1986.
4 Klein Nulend J., Veldhuijzen J.P., Strien M.E. van, Jong M. de, Burger E.H. Inhibition of osteoclast bone resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72, 1990.
5 van Loon J.J.W.A., van den Bergh L.C., Schelling R., Veldhijzen J.P., Huijser R.H. Development of a centrifuge for acceleration research in cell and developmental biology. 44th International Astronautical Congress, IAF/IAA-93-G.4-166, 39, Graz, Austria, 16-22 October 1993.
6 Ward F.O. Outlines of human osteology. 3rd edition, Henry Renshaw, London, 1836.
7 Wolff J. Das Gezetz der Transformation der Knochen, Berlin, 1892.